簡要描述:原代細(xì)胞分離是指由體內(nèi)取出組織或細(xì)胞進(jìn)行的*培養(yǎng),也叫初代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)離體時(shí)間短,遺傳性狀和體內(nèi)細(xì)胞相似,適于做細(xì)胞形態(tài)、功能和分化等研究。
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原代細(xì)胞分離
一、細(xì)胞培養(yǎng)
1.取材在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞(視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?,?jīng)過的處理(如消化分散細(xì)胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中,這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無取材這一過程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。
2.培養(yǎng)將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復(fù)蘇(可參閱后面有關(guān)章節(jié))為了保存細(xì)胞,特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株,要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以的冷卻速度凍存,終保存于液氮中。在極低的溫度下,細(xì)胞保存的時(shí)間是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
二、原代細(xì)胞分離
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。1懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。2實(shí)體組織材料的分離方法對于實(shí)體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。
三、細(xì)胞增殖檢測技術(shù)
目前主要有兩種用于檢測細(xì)胞增殖能力的方法。一種是直接的方法,通過直接測定進(jìn)行分裂的細(xì)胞數(shù)來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。另一種是間接的方法,即細(xì)胞活力(cellviability)檢測方法,通過檢測樣品中健康細(xì)胞的數(shù)目來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。顯然,細(xì)胞活力檢測法并不能證明檢測樣品中的細(xì)胞是否在增殖。如細(xì)胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動(dòng)凋亡程序,但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生;這時(shí)若采用細(xì)胞活力檢測法,顯然可以區(qū)分兩種條件下的細(xì)胞數(shù)量,但我們并不能從藥物干擾組細(xì)胞數(shù)大于對照組的事實(shí)說明藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論。所以直接的證據(jù)應(yīng)該采用方法一。
其中常見檢測:CCK8檢測法,MTT檢測法,Brdu檢測法,Edu檢測法,平板克隆形成。
四、細(xì)胞周期檢測技術(shù)
細(xì)胞周期指由細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程,所需的時(shí)間叫細(xì)胞周期時(shí)間。
常用的方法:流式檢測細(xì)胞周期,標(biāo)記有絲分裂百分率法。
五、細(xì)胞凋亡檢測
常見檢測方法:流式檢測細(xì)胞凋亡,線粒體膜電位,活性氧檢測,Hoechst染色,電鏡,TUNEL。
六、細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測
常見檢測方法:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell實(shí)驗(yàn),Invasion實(shí)驗(yàn)
七、其他實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞惡性程度:軟瓊脂實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞屏障:跨膜電阻、熒光黃透過率、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。
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